生化檢測的本質就是某物質化學變化的顯色反應，其反應過程可以劃分為四個區(qū)：延遲區(qū)、等速區(qū)、過渡區(qū)和平衡區(qū)，以時間為橫坐標、吸光度為縱坐標作圖，如下所示：

檢測波長在小于400nm的紫外光區(qū)，需要用石英比色皿或96孔UV板檢測；檢測波長在大于400nm的可見光區(qū)，玻璃/石英比色皿、96孔板均可檢測。若最終測定的反應液為有機試劑時（丙酮、乙酰乙酯、甲苯、氯仿等有機試劑），則需使用非聚苯乙烯材質的96孔板。

• 樣本選擇

新鮮樣本和冷凍樣本都可用于大多數指標的測定，但有一些生理活性物質容易降解，建議用新鮮樣本測定，如輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ、谷胱甘肽、線粒體復合體等。

• 樣本處理

動植物組織一般使用冰浴勻漿、液氮勻漿或者使用組織破碎儀進行勻漿。冰浴勻漿時注意防止摩擦升溫；液氮研磨時注意防止反復凍融并做好防護。

肝素鋰和EDTA抗凝血漿對某些酶法項目會有干擾，溶血、脂血、黃疸樣本會干擾吸光度法讀數，嚴重時要重采。血清需要及時分離避免細胞代謝改變分析物濃度。

細胞或細菌樣品收集后，在細胞或細菌沉淀中加入一定量的提取液，混勻，將細胞或細菌懸浮于提取液中，在冰水浴條件下用超聲破碎儀進行破碎。超聲后的細胞溶液變得透明、清澈，菌液從槍頭滴下不粘連。

土壤樣本建議將鮮土風干并過篩后取樣以保證重復性。風干后的土樣在-20℃保存1個月測定大部分酶活幾乎不會有損失，但硝態(tài)氮、銨態(tài)氮等成分在風干過程中會發(fā)生顯著變化，需用新鮮樣品分析。

• 樣本稀釋與濃縮

樣本測定值若超出檢測范圍，可以將提取的上清液用提取液稀釋后重新測定。一般從高到低，按照2倍，5倍，10倍，20倍的順序，選擇一個合適的稀釋倍數。

樣本測定值若低于檢測范圍，可以適當提高樣本濃度。

• 樣本保存

多數酶活或含量測定實驗，采集后建議在-20℃以下低溫保存。提取后的樣本上清液建議當天使用完畢，反復凍融會影響酶活或含量。

樣本保存過程中要盡可能避免樣品中擬測定指標發(fā)生變化，縮短冷凍時間。有條件的情況下，樣本取好后立即進行液氮速凍。如果不具備條件，也應該盡可能縮短樣本進入超低溫冰箱的時間。

冷凍樣本建議在-70℃或者液氮中保存。一般樣本在4℃能保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存3個月。制備好的勻漿液建議不要凍存，最好當天進行測定，如放置時間過長相關酶活會有所下降。

對于大體積樣本，應該把樣本分成小包裝再液氮速凍或者放入超低溫冰箱，避免反復凍融對樣本的破壞。

• 儀器校準、測定

分光光度計：預熱30min，用蒸餾水調零。

酶標儀：選擇正確波長。

• 加樣與反應

標準曲線制作（如需）：嚴格按說明書稀釋標準品（避免跳孔）。

加樣順序：建議“空白-標準品-樣本"減少誤差。所有反應孔（或比色皿）的加樣順序應保持一致，以保證反應時間相同。吸取不同試劑時應更換吸頭，配制不同組分時使用不同的儲液器皿，防止交叉污染。

反應條件控制：加樣后需充分混勻，確保顯色反應。嚴格按說明書要求控制反應溫度和反應時間，注意是否為避光反應。

分光光度法與微量法的反應體系、試劑濃度、儀器耗材均不同，不可混用或任意改變體系。

• 結果計算

生化試劑盒的結果計算通常基于特定的檢測原理（如終點法、速率法等），并通過公式將測定的吸光度（OD值）或其他信號值轉換為待測物的濃度或活性。反應結束后應立即測定，部分試劑盒要求在短時間內完成讀數，時間過久會影響結果。

• 計算ΔOD值

終點法：ΔOD=樣本OD-空白OD。

速率法：ΔOD/min=（反應末點OD-反應起點OD）/反應時間。

• 建立標準曲線（如需要）

以標準品濃度為橫坐標，對應ΔOD為縱坐標，繪制標準曲線。

• 樣本濃度計算

蛋白濃度校正：如需按蛋白濃度計算，需確認提取液是否可用于蛋白濃度測定；若提取液含蛋白沉淀劑或使蛋白變性，需另取樣本測定蛋白濃度。

標準曲線：一般可直接使用試劑盒提供的標準曲線方程。稀釋后的標準品應丟棄，不可保存使用。

批次一致性：若樣本量過多需分批次實驗，需確保試劑、儀器和操作步驟一致，避免批間誤差。

    驗證數據：