在多色流式實(shí)驗(yàn)中，熒光溢漏是導(dǎo)致通道信號(hào)難區(qū)分、設(shè)門不準(zhǔn)確的核心原因。隨著檢測(cè)指標(biāo)增多，熒光素光譜重疊的概率增加，單一熒光的溢漏會(huì)被多色疊加放大，整體熒光溢漏情況持續(xù)變化——這種情況下，未染色的空白對(duì)照（未涉及熒光溢漏干擾）或全通道同型對(duì)照（無(wú)法覆蓋多色交叉溢漏）均無(wú)法模擬全染背景，尤其對(duì)分群不明顯、低表達(dá)量指標(biāo)（需從大量陰性群體中識(shí)別陽(yáng)性信號(hào)），必須依賴減一對(duì)照(FMO對(duì)照，F(xiàn)luorescence Minus One)排除干擾。減一對(duì)照，又稱熒光扣除對(duì)照或圈門對(duì)照，是多色流式分析中針對(duì)特定通道的陰性對(duì)照。其操作邏輯為：對(duì)目標(biāo)通道不進(jìn)行熒光染色，其余所有檢測(cè)通道均按目標(biāo)樣本的染色方案完整染色，以此模擬“全染背景下，僅目標(biāo)通道無(wú)特異性信號(hào)"的場(chǎng)景。

該對(duì)照主要應(yīng)用于：研究不同細(xì)胞亞群的表型分子（如免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物）、細(xì)胞因子等指標(biāo)的檢測(cè)，尤其適用于多色（≥3色）實(shí)驗(yàn)或低表達(dá)指標(biāo)分析。

1.排除全染背景干擾：通過(guò)“缺失一個(gè)通道熒光"，直觀區(qū)分“目標(biāo)通道的特異性信號(hào)"與“其他通道溢漏至該通道的非特異性信號(hào)"；

2.評(píng)估熒光溢漏程度：量化其他熒光染料向目標(biāo)通道的溢漏比例，為補(bǔ)償調(diào)節(jié)和設(shè)門提供精準(zhǔn)依據(jù)；

3.確保設(shè)門準(zhǔn)確性：在低表達(dá)、分群模糊的場(chǎng)景中，明確陰性群體的信號(hào)邊界，避免因溢漏信號(hào)誤將陰性細(xì)胞判定為陽(yáng)性。

樣本中死細(xì)胞的存在會(huì)極大地影響染色效果，因?yàn)樗兰?xì)胞具有更大的自發(fā)熒光，而且會(huì)增加非特異性的抗體結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性并增加背景信號(hào)，降低陽(yáng)性信號(hào)的動(dòng)態(tài)范圍，這可能會(huì)使弱陽(yáng)性樣本和稀有細(xì)胞群體的鑒定變得困難。還可能會(huì)釋放DNA，DNA非常黏稠，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)，容易堵塞管路。此外，死細(xì)胞無(wú)法刺激表達(dá)活化功能相關(guān)的標(biāo)志物，從而導(dǎo)致一些比真實(shí)陽(yáng)性率低的假陰性結(jié)果產(chǎn)生。使用基于FSC和SSC的門可以幫助清除部分碎片和死細(xì)胞，但無(wú)法全部移除，因此需要借助靈敏且特異性的染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活性分析。其原理是利用細(xì)胞死亡后的通透性改變來(lái)做特異性熒光標(biāo)記，常見(jiàn)染料包括DNA染料類，分為兩種，一種是膜不透過(guò)性染料（如PI、7-AAD），僅標(biāo)記死細(xì)胞；另一類是膜透過(guò)性染料（如 Hoechst 33342），可標(biāo)記活細(xì)胞核，常用于活細(xì)胞示蹤或與 PI 聯(lián)合使用進(jìn)行死活雙染。而熒光標(biāo)記的Annexin V檢測(cè)凋亡細(xì)胞，可結(jié)合外翻的磷脂酰絲氨酸。此外，還可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞大小變化及理化性質(zhì)的測(cè)定進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。

其它實(shí)驗(yàn)對(duì)照，用于比較特定實(shí)驗(yàn)條件下樣本之間的差別，主要分為以下幾個(gè)類別：

1.陰性對(duì)照能夠提供所有待測(cè)標(biāo)志物的表達(dá)背景，用于比較細(xì)胞經(jīng)過(guò)化學(xué)或生物學(xué)處理后的蛋白表達(dá)差異，例如細(xì)胞內(nèi)染色實(shí)驗(yàn)涉及固定和破膜，這些步驟會(huì)影響抗原檢測(cè)、自發(fā)熒光、熒光染料亮度和細(xì)胞形態(tài)。

2.陽(yáng)性對(duì)照用于證實(shí)抗體在相關(guān)細(xì)胞中的陽(yáng)性染色，以表明抗體在實(shí)驗(yàn)中起作用。

3.縱向?qū)φ?/span>/參考對(duì)照是長(zhǎng)期研究的質(zhì)量控制，可以確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的染色一致性。